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분자 복제는 모든 학생과 연구원이 친숙해야하는 일반적인 생명 공학 방법입니다. 인간 DNA를 단편으로 절단하여 박테리아 세포의 플라스미드 DNA에 삽입 할 수있는 제한 효소라고하는 효소 유형을 사용하는 분자 클로닝. 제한 효소는 이중 가닥 DNA를 반으로 자릅니다. 제한 효소에 따라, 절단은 끈끈한 끝 또는 무딘 끝을 초래할 수 있습니다. 점착성 말단은 인간 DNA 단편이 플라스미드에 올바른 방향으로 삽입되도록하기 때문에 분자 클로닝에 더욱 유용하다. DNA가 끈적 끈적한 끝을 가질 때 결찰 과정 또는 DNA 조각의 융합은 더 적은 DNA를 요구합니다. 마지막으로, 각각의 효소가 상이한 제한 서열을 인식하더라도 다수의 점착성 말단 제한 효소는 동일한 점착성 말단을 생성 할 수있다. 이로 인해 관심있는 DNA 영역이 끈적한 엔드 효소에 의해 잘릴 수있는 가능성이 높아집니다.
제한 효소 및 제한 사이트
제한 효소는 절단 이중 가닥 DNA상의 특정 서열을 인식하고 그 서열에서 DNA를 절반으로 절단하는 효소이다. 인식 된 시퀀스를 제한 사이트라고합니다. 제한 효소는 엔도 뉴 클레아 제 (endonucleases)라고 불리며, 이는 DNA의 끝 사이에있는 위치에서 DNA가 정상적으로 존재하는 방식 인 이중 가닥 DNA를 절단하기 때문입니다. 90 가지가 넘는 제한 효소가 있습니다. 각각 고유 한 제한 사이트를 인식합니다. 제한 효소는 각각의 제한 부위를 인식하지 못하는 다른 부위보다 5,000 배 더 효율적으로 절단한다.
올바른 방향
제한 효소는 두 가지 일반 등급으로 제공됩니다. 그들은 DNA를 끈끈한 끝 또는 둔한 끝으로 자릅니다. 접착 성 말단은 DNA의 빌딩 블록 인 짧은 뉴클레오티드 영역을 가지고 있으며, 이는 짝을 이루지 않습니다. 이 짝이없는 지역을 오버행이라고합니다. 오버행은 상보적인 오버행 시퀀스를 갖는 다른 끈적한 끝을 원하기 때문에 끈적 거리는 것으로 알려져 있습니다. 끈적 끈적한 끝은 길을 잃은 쌍둥이와 같습니다. 일단 만나면 서로를 단단히 안아줍니다. 반면에, 모든 뉴클레오티드가 이미 두 가닥의 DNA 사이에 쌍을 이루기 때문에 무딘 말단은 끈적 거리지 않습니다. 점착성 말단의 장점은 인간 DNA 단편이 한 방향으로 박테리아 플라스미드에만 적합 할 수 있다는 것이다. 대조적으로, 인간 DNA 및 박테리아 플라스미드 둘 다 무딘 말단을 갖는 경우, 인간 DNA는 플라스미드 내로 머리에서 꼬리로 또는 꼬리에서 머리로 삽입 될 수있다.
끈끈한 끝을 합치면 DNA가 덜 필요합니다.
스틱 엔드가있는 DNA는 "끈적임"으로 인해 서로를 찾기가 더 쉬워 지지만, 스틱 엔드 또는 무딘 엔드는 연속 된 DNA 조각으로 서로 융합 될 수 없습니다. 완전히 연결된 연속 DNA 조각을 형성하려면 리가 아제 (ligase)라고하는 효소가 필요합니다. 리가 제는 점착성 또는 무딘 말단에서 뉴클레오티드의 골격을 연결하여 뉴클레오티드의 연속 쇄를 생성한다. 점착성 말단은 서로에 대한 인력으로 인해 서로를 더 빨리 발견하기 때문에, 결찰 과정은 더 적은 인간 DNA 및 더 적은 플라스미드 DNA를 필요로한다. DNA와 플라스미드의 뭉툭한 끝은 서로를 찾을 가능성이 적기 때문에 뭉툭한 끝을 연결하려면 더 많은 DNA를 시험관에 넣어야합니다.
다른 효소는 같은 끈적 끈적한 끝을 줄 수 있습니다
제한 부위는 유기체의 게놈 전체에 위치하지만 균등하지 않습니다. 플라스미드에서는 서로 바로 옆에 위치하도록 조작 할 수 있습니다. 인간 게놈에서 인간 DNA 단편을 잘라내려는 과학자들은 단편의 앞뒤에있는 제한 부위를 찾아야합니다. DNA 단편이 올바른 방향으로 삽입되도록하는 것 외에도, 상이한 점착성 말단 효소는 상이한 제한 서열을 인식하더라도 동일한 점착성 말단을 생성 할 수있다. 예를 들어, BamHI, BglII 및 Sau3A는 인식 시퀀스가 다르지만 동일한 GATC 접착 끝을 생성합니다. 이것은 당신의 관심있는 인간 유전자 옆에있는 끈끈한 끝 제한 위치가있을 가능성을 증가시킵니다.