세포에서 MRNA를 분리하는 방법

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• 총 RNA로부터 mRNA의 분리
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세포의 유전자 파란색은 유전자 물질 또는 DNA 내에 인코딩됩니다. DNA가 절대로 세포의 핵을 떠나지 않기 때문에,이 정보가 다른 단백질과 생화학 성분이 존재하는 세포질에 들어가려면 먼저 DNA를 메신저 RNA (mRNA 또는 poly (A) RNA)로 전사해야합니다. 이 mRNA는 이후 세포의 많은 기능을 수행하는 단백질로 번역된다. 매우 드문 mRNA를 검출하거나 정량화하거나, 마이크로 어레 이용 프로브를 만들거나 상보적인 DNA 분자 라이브러리를 구성하려면 mRNA를 분리해야합니다. 그러나, 전체 RNA (즉, 세포 내의 모든 RNA) 추출 및 후속 mRNA 분리는 상호 배타적 인 과정이 아니다; mRNA를 추출하려면 전자를 수행해야합니다.

총 RNA로부터 mRNA의 분리

TRIzol 균질화 : 전체 RNA에는 모든 mRNA, 전이 RNA, 리보솜 RNA 및 기타 비 코딩 RNA가 포함됩니다. 이들을 다른 셀룰러 구성 요소로부터 분리하기 위해, 셀은 먼저 내용물을 방출하기 위해 버스트 개방된다. 이는 TRIzol Reagent (Life Technologies)에서 원심 분리 (고속으로 회전)하여 펠렛 세포를 재현 탁함으로써 수행됩니다. 다른 버전의 TRIzol (예 : Ambion의 TRI 시약)도 비슷하게 작동합니다.

총 RNA 분리 : 일련의 원심 분리를 사용하여 세포의 여러 성분 (단백질, DNA, RNA)을 현탁액 내의 층 또는 상으로 분리합니다. 상단의 황색상은 지방으로 구성되어 폐기 할 수 있습니다. 원하는상은 적색으로 착색되고, 전체 RNA를 함유하며 유지된다. 이소프로판올 및 에탄올을 사용하여 페놀-클로로포름 추출 및 일련의 알코올 세척을 수행 한 후, mRNA 분리를 위해 RNA를 펠릿화할 수있다. 이 효소가 전체 RNA를 분해하지 못하도록 RNase 억제제를 첨가하십시오.

mRNA 추출 : 수제 실험실 프로토콜이 대량의 고순도 mRNA를 생성하지 않기 때문에 키트를 사용하여 mRNA를 분리하는 것이 일반적입니다. 상용 키트에는 Invitrogen의 FastTrack 2.0 또는 Ambion의 Poly (A) Pure mRNA 격리 키트가 포함됩니다. 이러한 기본 단계는 해당 키트에 공통입니다.

a) 키트에 제공된 RNase 억제 용해 완충액을 최대 300 마이크로 리터의 총 RNA와 혼합합니다.

b) 섭씨 65도에서 5 분 동안 가열 한 다음 얼음에서 즉시 1 분 동안 냉각시킵니다.

c) 이것을 0.5M 염화나트륨과 혼합 한 다음이 샘플에 Oligo dT (oligodeoxythymidylic acid)를 완전히 용해시킨다.

d)이 샘플을 원심 분리하고 상청액을 회수하여 키트에 제공된 일련의 결합 및 저염 완충액으로 여러 번 세척합니다.

e) 키트 지정 부피 (예 : 500 마이크로 리터)가 얻어 질 때까지 mRNA를 여러 번 용리합니다.

f) 아세트산 나트륨 및 에탄올 침전에 의해 용출액을 침전시킨다. 최대 20 마이크로 리터의 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC) 처리 수에 재현 탁합니다.

g) 섭씨 -80도에서 보관하고 분광 광도계로 품질과 수량을 확인하십시오.

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